Proovi ettevalmistus: mis juhtub enne sinu DNA järjestamist?
Enne kui saame sinu DNA järjestada, peame ette valmistama üksikud molekulid, mis saab laadida meie sekvenaatorisse.
4 min lugemist
Sinu genoom on umbes kolm miljardit tähte pikk ja kirjutatud nelja keemilise alusega: A, C, G ja T. Selle lugemine tähendab nende tähtede järjekorra väljaselgitamist. Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) on tehnoloogiate rühm, mis muutis kogu inimgenoomi lugemise kiireks ja tavapäraseks, lugedes miljoneid lühikesi DNA tükke korraga, mitte ühe kaupa.
Enne NGS-i: üks fragment korraga
Esimene praktiline meetod, Sangeri sekveneerimine, töötati välja 1970. aastatel. See loeb ühes reaktsioonis ühte DNA lõiku, kuni umbes tuhat tähte. See on väga täpne ja seda kasutatakse siiani üksikute tulemuste kinnitamiseks, kuid kogu genoomi lugemine selle meetodiga tähendab kordamist miljoneid kordi. Inimgenoomi projekt, mis kasutas seda esimese referentsgenoomi loomiseks, võttis kolmteist aastat ja laboreid üle maailma.
Suur idee: massiivne paralleelne sekveneerimine
NGS jagab genoomi miljoniteks lühikesteks fragmentideks ja loeb need kõik korraga. Iga fragment annab lühikese järjestuse, mida nimetatakse lugemiseks, ja ühe seadme töötsükkel võib neid toota miljardeid. Seejärel paneb tarkvara lugemid taas kokku. Just see paralleelsus muutis kümnendi pikkuse projekti midagi, mida labor saab teha päevadega.
Kuidas see töötab, samm-sammult
- Ekstraheerimine. DNA puhastatakse proovist, näiteks sülitisest, mis sisaldab põsekoe rakke.
- Raamatukogu ettevalmistamine. DNA lõigatakse lühikesteks fragmentideks, tavaliselt paarisada tähte pikkadeks, ning iga otsa kinnitatakse lühikesed sünteetilised järjestused, mida nimetatakse adapteriteks. Adapterid võimaldavad seadmel iga fragmenti haarata ja lugeda.
- Paljundamine. Kõige laialdasemalt kasutatavatel platvormidel kinnituvad fragmendid klaasist voolurakule ja kopeeritakse kohapeal, nii et igast saab tihe klaster identseid koopiaid, mis on piisavalt heledad tuvastamiseks.
- Sekveneerimine sünteesi teel. Seade ehitab iga fragmendi kõrvale uue ahela, üks täht tsükli kohta, kasutades A, C, G ja T jaoks erineva fluorestseeruva värviga märgistatud aluseid. Kaamera salvestab, milline värv igas klastris süttib, tsükkel tsükli järel, ja värvide jada muutub tähtede jadaks.
- Lugemised. Tulemuseks on väga suur fail lühikestest lugemistest, mis on sageli umbes 150 tähe pikkused ja loetakse sageli fragmendi mõlemast otsast (paarisotsaga lugemised), iga täht koos kvaliteedinäitajaga.
Katvus: miks iga täht loetakse mitu korda
Ükski üksik lugemine ei ole täiuslik, seetõttu loetakse genoomi iga positsiooni mitu korda kattuvate fragmentide abil. Positsiooni katvate lugemiste keskmist arvu nimetatakse katvuseks ehk sügavuseks. Kliiniline kogugenoomi sekveneerimine püüab tavaliselt keskmist katvust umbes 30x, mis tähendab, et iga täht loetakse umbes kolmkümmend korda. See võimaldab eristada tegelikke erinevusi juhuslikest lugemisvigadest.
Lugemistest tulemusteni
Toorlugemised on alles algus. Bioinformaatika tarkvara joondab iga lugemise selle kohale inimese referentsgenoomis ja võrdleb seejärel sinu järjestust referentsiga, et leida kohad, kus need erinevad, mida nimetatakse variantide tuvastamiseks. Need variandid märgitakse seejärel teadaoleva infoga.
Lühikesed ja pikad lugemised
Ülal kirjeldatud meetod annab lühikesi lugemisi, mis on väga täpsed ja ökonoomsed ning on kogugenoomi sekveneerimise töötav tööhobune. Pikkade lugemiste tehnoloogiad loevad üksikuid molekule, mis on tuhandeid tähti pikad. Need on paremad korduvate piirkondade ja suurte struktuurimuutuste katmisel ning neid kahte lähenemist kasutatakse üha enam koos.
Miks see sinu jaoks oluline on
Kuna NGS loeb genoomi paralleelselt, on praktiline sekveneerida kogu genoom, mitte vaid mõned eelnevalt valitud positsioonid. Just see on erinevus terve genoomi sekveneerimise ja testide vahel, mis vaatavad ainult valitud geene või teadaolevaid markereid.