Mintaelőkészítés: mi történik a DNS-ének szekvenálása előtt?
Mielőtt szekvenálhatnánk az Ön DNS-ét, egyedi molekulákat kell előkészítenünk, amelyeket be lehet tölteni szekvenálónkba.
4 perc olvasás
Az Ön genomja nagyjából hárommilliárd betűből áll, amelyeket négy kémiai bázis alkot: A, C, G és T. A genom olvasása azt jelenti, hogy meghatározzuk ezeknek a betűknek a sorrendjét. A nagy áteresztőképességű szekvenálás (NGS) olyan technológiák összessége, amelyek a teljes emberi genom gyors és rutinszerű leolvasását tették lehetővé: egyszerre millió rövid DNS-darabot olvasnak, nem pedig egyesével.
Az NGS előtt: egyszerre egy töredék
Az első gyakorlati módszer, a Sanger-szekvenálás az 1970-es években készült el. Egy reakcióban egyetlen DNS-szakaszt olvas le, legfeljebb mintegy ezer betű hosszúságban. Nagyon pontos, és ma is használják az egyes eredmények megerősítésére, de a teljes genom ezzel a módszerrel történő leolvasásához milliószor kellene megismételni. Az Emberi Genom Program, amely ezzel a módszerrel állította elő az első referenciagenomot, tizenhárom évet vett igénybe és világszerte laboratóriumok munkáját.
A nagy ötlet: tömegesen párhuzamos szekvenálás
Az NGS a genomot millió rövid töredékre bontja, és mindegyiket egyszerre olvassa le. Minden töredékből egy rövid szekvencia, az úgynevezett olvasat (read) származik, és egyetlen műszerfutás belőlük akár milliárdot is előállíthat. A szoftver ezután visszaillesztse az olvasatokat egymáshoz. Ez a párhuzamosság tette azt, hogy egy évtizedes projektből olyan feladat lett, amelyet a laboratórium napok alatt el tud végezni.
Működése lépésről lépésre
- Kivonás. A DNS-t a mintából tisztítják, például nyálból, amely a szája belső faláról származó sejteket tartalmaz.
- Könyvtárkészítés. A DNS-t rövid darabokra vágják, jellemzően néhány száz betű hosszúságúra, és minden darab mindkét végéhez rövid, szintetikus szekvenciákat, úgynevezett adaptereket kapcsolnak. Az adapterek teszik lehetővé, hogy a műszer minden darabot befogjon és leolvasson.
- Felsokszorozás. A legelterjedtebb platformokon a töredékek egy üveg áramlási cellához kötődnek, és helyben lemásolódnak, így mindegyikből azonos másolatok szoros klasztere lesz, amely elég fényes ahhoz, hogy kimutatható legyen.
- Szintézis közbeni szekvenálás. A műszer minden töredék mellett egy új szálat épít, ciklusonként egy betűvel, olyan bázisokat használva, amelyek A, C, G és T esetén más-más fluoreszkáló színnel vannak megjelölve. Egy kamera rögzíti, melyik szín világít fel minden klaszterben, ciklusról ciklusra, és a színek sorrendje lesz a betűk sorrendje.
- Olvasatok. Az eredmény egy nagyon nagy méretű fájl rövid olvasatokkal, amelyek gyakran körülbelül 150 betű hosszúak, és gyakran a töredék mindkét végéről olvasták le őket (párosított végű olvasatok), minden betűhöz egy minőségi pontszámmal.
Lefedettség: miért olvasnak minden betűt sokszor el
Egyetlen olvasat sem tökéletes, ezért a genom minden pozícióját átfedő töredékek sokszor leolvassák. Azt, hogy egy pozíciót átlagosan hány olvasat fed le, lefedettségnek vagy mélységnek nevezzük. A klinikai teljes genom-szekvenálás általában átlagosan körülbelül 30x lefedettséget céloz, ami azt jelenti, hogy minden betűt nagyjából harmincszor olvasnak le, és ez teszi lehetővé, hogy a valódi eltéréseket meg lehessen különböztetni az alkalmi leolvasási hibáktól.
Az olvasatoktól az eredményekig
A nyers olvasatok csak a kezdet. A bioinformatikai szoftver minden olvasatot a referencia emberi genomban elfoglalt helyéhez illeszt, majd összehasonlítja az Ön szekvenciáját a referenciával, hogy megtalálja azokat a pozíciókat, ahol eltérnek egymástól. Ezt a lépést változatazonosításnak (variant calling) nevezik. A változatokat ezután annotálják azzal, amit róluk eddig tudnak.
Rövid és hosszú olvasatok
A fent leírt módszer rövid olvasatokat állít elő, amelyek nagyon pontosak és gazdaságosak, és a teljes genom-szekvenálás munkalova. A hosszú olvasatú technológiák ezer betű hosszúságú egyedi molekulákat olvasnak le. Jobbak az ismétlődő régiók és a nagy szerkezeti változások átívelésében, és a két megközelítést egyre gyakrabban együtt alkalmazzák.
Miért fontos ez Önnek
Mivel a NGS a genomot párhuzamosan olvassa, gyakorlatias az egész genom szekvenálása, nem pedig néhány előre kiválasztott pozícióé. Ez a különbség a teljes genom szekvenálás és azon tesztek között, amelyek csak kiválasztott géneket vagy ismert markereket vizsgálnak.