Prøveforberedelse: Hvad sker der, før vi sekventerer dit DNA?
Før vi kan sekventere dit DNA, skal vi forberede enkelte molekyler, der kan indlæses i vores sekventeringsmaskine.
4 min læsning
Dit genom er omkring tre milliarder bogstaver langt og skrevet med fire kemiske baser: A, C, G og T. At læse det betyder at finde ud af rækkefølgen af disse bogstaver. Næste generations sekventering (NGS) er den familie af teknologier, der gjorde det hurtigt og rutinepræget at læse et helt menneskeligt genom, ved at læse millioner af korte DNA-stykker samtidig i stedet for ét ad gangen.
Før NGS: ét fragment ad gangen
Den første praktiske metode, Sanger-sekventering, blev udviklet i 1970'erne. Den læser ét DNA-stræk, op til omkring tusind bogstaver, per reaktion. Den er meget præcis og bruges stadig til at bekræfte enkeltresultater, men at læse et helt genom på denne måde betyder at gentage processen millioner af gange. Human Genome Project, som brugte den til at producere det første referencegenom, tog tretten år og laboratorier over hele verden.
Den store idé: massivt parallel sekventering
NGS opdeler genomet i millioner af korte fragmenter og læser dem alle på én gang. Hvert fragment giver en kort sekvens, kaldet en læsning, og en enkelt instrumentkørsel kan producere milliarder af dem. Software sætter derefter læsningerne sammen igen. Det er denne parallelitet, der gjorde et projekt, der tog et årti, til noget et laboratorium kan udføre på dage.
Sådan fungerer det, trin for trin
- Ekstraktion. DNA renses fra en prøve, for eksempel spyt, som indeholder celler fra indersiden af kinden.
- Biblioteksforberedelse. DNA'et klippes i korte fragmenter, typisk nogle hundrede bogstaver lange, og korte syntetiske sekvenser kaldet adaptere sættes på hver ende. Adaptere gør det muligt for instrumentet at fange og læse hvert fragment.
- Forstærkning. På de mest udbredte platforme hæfter fragmenter sig til en glasflowcelle og kopieres på stedet, så hvert enkelt vokser til en tæt klynge af identiske kopier, der er lys nok til at blive registreret.
- Sekventering ved syntese. Instrumentet bygger en ny streng ved siden af hvert fragment, ét bogstav per cyklus, ved hjælp af baser mærket med en forskellig fluorescerende farve for A, C, G og T. Et kamera registrerer, hvilken farve der lyser op i hver klynge, cyklus efter cyklus, og rækkefølgen af farver bliver til rækkefølgen af bogstaver.
- Læsninger. Resultatet er en meget stor fil med korte læsninger, ofte omkring 150 bogstaver hver, ofte læst fra begge ender af et fragment (parrede læsninger), med en kvalitetsscore for hvert bogstav.
Dækning: hvorfor hvert bogstav læses mange gange
Ingen enkelt læsning er perfekt, så hver position i genomet læses mange gange af overlappende fragmenter. Det gennemsnitlige antal læsninger, der dækker en position, kaldes dækning eller dybde. Klinisk helgenomsekventering sigter typisk efter en gennemsnitlig dækning på omkring 30x, hvilket betyder, at hvert bogstav læses omkring tredive gange, og det gør det muligt at skelne reelle forskelle fra lejlighedsvise læsefejl.
Fra læsninger til resultater
Rå læsninger er kun begyndelsen. Bioinformatisk software sammenligner hver læsning med dens plads i et referencegenom for mennesker og sammenligner derefter din sekvens med referencen for at finde de positioner, hvor de afviger, et trin kaldet variantkald. Disse varianter annoteres derefter med det, der er kendt om dem.
Korte læsninger og lange læsninger
Metoden beskrevet ovenfor giver korte læsninger, som er meget præcise og økonomiske, og den er arbejdshesten i helgenomsekventering. Teknologier med lange læsninger læser enkelte molekyler, der er tusinder af bogstaver lange. De er bedre til at spænde over gentagne regioner og store strukturelle ændringer, og de to tilgange bruges i stigende grad sammen.
Hvorfor det betyder noget for dig
Fordi NGS læser genomet parallelt, er det praktisk at sekventere hele det i stedet for et fåtal forudvalgte positioner. Det er forskellen mellem helgenomsekventering og tests, der kun undersøger udvalgte gener eller kendte markører.