Vad är nästa generations sekvensering?

Ditt genom är cirka tre miljarder bokstäver långt, skrivet med fyra kemiska baser: A, C, G och T. Att läsa det innebär att ta reda på i vilken ordning dessa bokstäver står. Nästa generations sekvensering (NGS) är samlingsnamnet för de tekniker som gjort det snabbt och rutinmässigt att läsa ett helt mänskligt genom, genom att läsa miljontals korta DNA-bitar samtidigt i stället för en i taget.

Före NGS: ett fragment i taget

Den första praktiskt användbara metoden, Sangersekvensering, utvecklades på 1970-talet. Den läser en enskild DNA-sträcka, upp till cirka tusen bokstäver, per reaktion. Den är mycket noggrann och används fortfarande för att bekräfta enskilda resultat, men att läsa ett helt genom på detta sätt innebär att upprepa den miljontals gånger. Humangenomprojektet, som använde metoden för att ta fram det första referensgenomet, tog tretton år och laboratorier runt om i världen.

Den stora idén: massivt parallell sekvensering

NGS delar upp genomet i miljontals korta fragment och läser alla samtidigt. Varje fragment ger en kort sekvens, kallad en avläsning, och en enda körning i ett instrument kan ge miljarder sådana. Programvara sätter sedan ihop avläsningarna igen. Det är parallelliteten som gjorde att ett projekt som tog ett decennium blivit något ett laboratorium kan göra på några dagar.

Så fungerar det, steg för steg

1. Extraktion. DNA renas från ett prov, till exempel saliv, som innehåller celler från insidan av kinden.
2. Biblioteksförberedelse. DNA:t klipps i korta fragment, vanligtvis några hundra bokstäver långa, och korta syntetiska sekvenser som kallas adaptrar fästs i varje ände. Adaptrarna gör att varje fragment kan fångas och läsas av instrumentet.
3. Förstärkning. På de mest använda plattformarna fäster fragmenten vid en glasflödescell och kopieras på plats, så att varje fragment växer till ett tätt kluster av identiska kopior som är tillräckligt starkt lysande för att kunna detekteras.
4. Sekvensering genom syntes. Instrumentet bygger en ny sträng bredvid varje fragment, en bokstav per cykel, med baser märkta i olika fluorescerande färger för A, C, G och T. En kamera registrerar vilken färg som lyser i varje kluster, cykel efter cykel, och färgsekvensen blir bokstavssekvensen.
5. Avläsningar. Resultatet är en mycket stor fil med korta avläsningar, ofta cirka 150 bokstäver vardera, ofta lästa från båda ändarna av ett fragment (parvisa avläsningar), med en kvalitetspoäng för varje bokstav.

Täckning: varför varje bokstav läses många gånger

Ingen enskild avläsning är perfekt, så varje position i genomet läses många gånger av överlappande fragment. Det genomsnittliga antalet avläsningar som täcker en position kallas täckning eller djup. Kliniska helgenomsekvenser siktar vanligtvis på ett genomsnitt på cirka 30x, vilket innebär att varje bokstav läses cirka trettio gånger. Det gör det möjligt att skilja verkliga skillnader från enstaka läsfel.

Från avläsningar till resultat

Råa avläsningar är bara början. Bioinformatisk programvara placerar varje avläsning på rätt plats i ett referensgenom för människa och jämför sedan din sekvens med referensen för att hitta de positioner där de skiljer sig åt, ett steg som kallas variantanrop. Dessa varianter annoteras sedan med det som är känt om dem.

Korta och långa avläsningar

Metoden som beskrivs ovan ger korta avläsningar, som är mycket noggranna och ekonomiska, och är arbetshästen i helgenomsekvensering. Tekniker för långa avläsningar läser enskilda molekyler som är tusentals bokstäver långa. De är bättre på att spänna över repetitiva regioner och stora strukturella förändringar, och de två metoderna används allt oftare tillsammans.

Varför det är viktigt för dig

Eftersom NGS läser genomet parallellt är det praktiskt att sekvensera hela genomet i stället för ett fåtal förutbestämda positioner. Det är skillnaden mellan helgenomsekvensering och tester som bara undersöker utvalda gener eller kända markörer.