Προετοιμασία δείγματος: τι συμβαίνει προτού αλληλουχίσουμε το DNA σας;
Πριν μπορέσουμε να αλληλουχίσουμε το DNA σας, πρέπει να προετοιμάσουμε μεμονωμένα μόρια που μπορούν να φορτωθούν στον αλληλουχιστή μας.
Ανάγνωση 4 λεπτών
Το γονιδίωμά σας έχει μήκος περίπου τρία δισεκατομμύρια γράμματα, γραμμένα με τέσσερις χημικές βάσεις: A, C, G και T. Η ανάγνωσή του σημαίνει τον προσδιορισμό της σειράς αυτών των γραμμάτων. Η αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) είναι η οικογένεια τεχνολογιών που έκανε την ανάγνωση ολόκληρου του ανθρώπινου γονιδιώματος γρήγορη και συνηθισμένη, διαβάζοντας εκατομμύρια σύντομα τμήματα DNA ταυτόχρονα αντί για ένα κάθε φορά.
Πριν από το NGS: ένα τμήμα κάθε φορά
Η πρώτη πρακτική μέθοδος, η αλληλούχιση Sanger, αναπτύχθηκε τη δεκαετία του 1970. Διαβάζει ένα μεμονωμένο τμήμα DNA, έως περίπου χίλια γράμματα, ανά αντίδραση. Είναι πολύ ακριβής και εξακολουθεί να χρησιμοποιείται για την επιβεβαίωση μεμονωμένων αποτελεσμάτων, αλλά η ανάγνωση ολόκληρου γονιδιώματος με αυτόν τον τρόπο σημαίνει την επανάληψή της εκατομμύρια φορές. Το Πρόγραμμα Ανθρώπινου Γονιδιώματος, που την χρησιμοποίησε για να παράγει το πρώτο γονιδίωμα αναφοράς, διήρκεσε δεκατρία χρόνια και απαίτησε εργαστήρια από όλο τον κόσμο.
Η μεγάλη ιδέα: μαζική παράλληλη αλληλούχιση
Το NGS χωρίζει το γονιδίωμα σε εκατομμύρια σύντομα τμήματα και τα διαβάζει όλα ταυτόχρονα. Κάθε τμήμα δίνει μια σύντομη αλληλουχία, που ονομάζεται ανάγνωσμα, και μία μόνο εκτέλεση της συσκευής μπορεί να παράγει δισεκατομμύρια από αυτά. Στη συνέχεια το λογισμικό συνθέτει ξανά τα αναγνώσματα. Αυτός ο παραλληλισμός είναι που μετέτρεψε ένα έργο δεκαετίας σε κάτι που ένα εργαστήριο μπορεί να κάνει σε ημέρες.
Πώς λειτουργεί, βήμα προς βήμα
- Εκχύλιση. Το DNA καθαρίζεται από ένα δείγμα, όπως το σάλιο, το οποίο περιέχει κύτταρα από το εσωτερικό της παρειάς σας.
- Προετοιμασία βιβλιοθήκης. Το DNA κόβεται σε σύντομα τμήματα, συνήθως μερικών εκατοντάδων γραμμάτων, και σε κάθε άκρο προσαρτώνται σύντομες συνθετικές αλληλουχίες που ονομάζονται προσαρμοστές. Οι προσαρμοστές επιτρέπουν σε κάθε τμήμα να συλλαμβάνεται και να διαβάζεται από τη συσκευή.
- Ενίσχυση. Στις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες πλατφόρμες, τα τμήματα προσκολλώνται σε γυάλινη κυψέλη ροής και αντιγράφονται στη θέση τους, ώστε καθένα να μεγαλώνει σε ένα πυκνό σύμπλεγμα πανομοιότυπων αντιγράφων, αρκετά φωτεινό ώστε να ανιχνευθεί.
- Αλληλούχιση με σύνθεση. Η συσκευή κατασκευάζει μια νέα αλυσίδα δίπλα σε κάθε τμήμα, ένα γράμμα ανά κύκλο, χρησιμοποιώντας βάσεις με διαφορετικό φθορίζον χρώμα για τα A, C, G και T. Μια κάμερα καταγράφει ποιο χρώμα ανάβει σε κάθε σύμπλεγμα, κύκλο με κύκλο, και η ακολουθία των χρωμάτων γίνεται η ακολουθία των γραμμάτων.
- Αναγνώσματα. Το αποτέλεσμα είναι ένα πολύ μεγάλο αρχείο με σύντομα αναγνώσματα, συχνά περίπου 150 γραμμάτων το καθένα, που συχνά διαβάζονται και από τα δύο άκρα ενός τμήματος (ζεύγη αναγνωσμάτων), με βαθμό ποιότητας για κάθε γράμμα.
Κάλυψη: γιατί κάθε γράμμα διαβάζεται πολλές φορές
Κανένα μεμονωμένο ανάγνωσμα δεν είναι τέλειο, γι' αυτό κάθε θέση στο γονιδίωμα διαβάζεται πολλές φορές από επικαλυπτόμενα τμήματα. Ο μέσος αριθμός αναγνωσμάτων που καλύπτουν μια θέση ονομάζεται κάλυψη ή βάθος. Η κλινική αλληλούχιση ολόκληρου γονιδιώματος συνήθως στοχεύει σε μέση τιμή περίπου 30x, πράγμα που σημαίνει ότι κάθε γράμμα διαβάζεται περίπου τριάντα φορές, γεγονός που επιτρέπει να διακρίνονται οι πραγματικές διαφορές από τα περιστασιακά σφάλματα ανάγνωσης.
Από τα αναγνώσματα στα αποτελέσματα
Τα ακατέργαστα αναγνώσματα είναι μόνο η αρχή. Λογισμικό βιοπληροφορικής ευθυγραμμίζει κάθε ανάγνωσμα στη θέση του σε ένα γονιδίωμα αναφοράς του ανθρώπου και στη συνέχεια συγκρίνει τη δική σας αλληλουχία με την αναφορά, για να εντοπίσει τις θέσεις όπου διαφέρουν, βήμα που ονομάζεται κλήση παραλλαγών. Οι παραλλαγές αυτές στη συνέχεια σχολιάζονται με όσα είναι γνωστά γι' αυτές.
Σύντομα και μακρά αναγνώσματα
Η μέθοδος που περιγράφηκε παραπάνω παράγει σύντομα αναγνώσματα, τα οποία είναι πολύ ακριβή και οικονομικά, και αποτελούν το βασικό εργαλείο της αλληλούχισης ολόκληρου γονιδιώματος. Οι τεχνολογίες μακρών αναγνωσμάτων διαβάζουν μεμονωμένα μόρια μήκους χιλιάδων γραμμάτων. Είναι καλύτερες στην κάλυψη επαναλαμβανόμενων περιοχών και μεγάλων δομικών αλλαγών, και οι δύο προσεγγίσεις χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο μαζί.
Γιατί έχει σημασία για εσάς
Επειδή το NGS διαβάζει το γονιδίωμα παράλληλα, είναι πρακτικό να αλληλουχηθεί όλο το γονιδίωμα και όχι μόνο ένας περιορισμένος αριθμός προεπιλεγμένων θέσεων. Αυτή είναι η διαφορά ανάμεσα στην ολική αλληλούχιση γονιδιώματος και σε εξετάσεις που εξετάζουν μόνο επιλεγμένα γονίδια ή γνωστούς δείκτες.