Numune hazırlığı: DNA'nızı dizilemeden önce neler oluyor?
DNA'nızı dizilemeden önce, her biri sekanslayıcımıza yüklenebilecek ayrı moleküller hazırlamamız gerekir.
4 dakikalık okuma
Genomunuz yaklaşık üç milyar harf uzunluğundadır ve A, C, G ve T olmak üzere dört kimyasal bazla yazılmıştır. Onu okumak, bu harflerin sırasını belirlemek demektir. Yeni nesil dizileme (NGS), DNA'nın kısa parçalarını tek tek değil aynı anda milyonlarca parça halinde okuyarak tüm insan genomunun hızlı ve rutin biçimde okunmasını mümkün kılan teknolojiler ailesidir.
NGS öncesi: bir seferde bir parça
İlk pratik yöntem olan Sanger dizilemesi 1970'lerde geliştirildi. Her reaksiyonda tek bir DNA dizisini, yaklaşık bin harfe kadar okur. Çok doğrudur ve bireysel sonuçları doğrulamak için hâlâ kullanılır; ancak bu yöntemle bir genomu okumak, işlemi milyonlarca kez tekrarlamak anlamına gelir. İlk referans genomu üretmek için bu yöntemi kullanan İnsan Genom Projesi, dünya genelindeki laboratuvarlarda on üç yıl sürdü.
Büyük fikir: kitlesel paralel dizileme
NGS, genomu milyonlarca kısa parçaya böler ve hepsini aynı anda okur. Her parça, okuma adı verilen kısa bir dizi verir ve tek bir cihaz çalıştırması bunlardan milyarlarca üretebilir. Ardından yazılım okumaları yeniden birleştirir. Bu paralellik, on yıl süren bir projeyi laboratuvarın günler içinde yapabileceği bir işe dönüştürdü.
Adım adım nasıl çalışır
- Ekstraksiyon. DNA, yanağınızın iç yüzeyindeki hücreleri içeren tükürük gibi bir örnekten saflaştırılır.
- Kütüphane hazırlığı. DNA, genellikle birkaç yüz harf uzunluğunda kısa parçalara kesilir ve her ucuna adaptör adı verilen kısa sentetik diziler eklenir. Adaptörler, her parçanın cihaz tarafından yakalanıp okunabilmesini sağlar.
- Çoğaltma. En yaygın kullanılan platformlarda parçalar cam bir akış hücresine tutunur ve yerinde kopyalanır; böylece her biri, tespit edilecek kadar parlak, sıkı bir aynı kopya kümesine dönüşür.
- Sentez yoluyla dizileme. Cihaz, her parçanın yanında yeni bir zincir oluşturur; her döngüde bir harf eklenir ve A, C, G, T için farklı floresan renkle etiketlenmiş bazlar kullanılır. Bir kamera, her döngüde her kümede hangi rengin yandığını kaydeder ve renk dizisi harf dizisine dönüşür.
- Okumalar. Sonuç, genellikle her biri yaklaşık 150 harf uzunluğunda, çoğu zaman bir parçanın her iki ucundan okunan (eşleştirilmiş uçlu okumalar) çok büyük bir kısa okuma dosyasıdır ve her harf için bir kalite puanı içerir.
Kapsama: neden her harf defalarca okunur
Hiçbir tek okuma mükemmel değildir; bu nedenle genomdaki her pozisyon, örtüşen parçalar tarafından defalarca okunur. Bir pozisyonu kapsayan okumaların ortalama sayısına kapsama veya derinlik denir. Klinik tam genom dizilemesinde genellikle ortalama yaklaşık 30x hedeflenir; yani her harf yaklaşık otuz kez okunur. Bu sayede gerçek farklılıklar, ara sıra görülen okuma hatalarından ayırt edilebilir.
Okumalardan sonuçlara
Ham okumalar yalnızca başlangıçtır. Biyoinformatik yazılımı, her okumayı bir referans insan genomundaki yerine hizalar, ardından sizin diziniz ile referansı karşılaştırarak farklılaştıkları pozisyonları bulur; bu adıma varyant çağırma denir. Bu varyantlar daha sonra hakkında bilinenlerle açıklanır.
Kısa okumalar ve uzun okumalar
Yukarıda anlatılan yöntem, yüksek doğrulukta ve ekonomik olan kısa okumalar üretir ve tam genom dizilemesinin temel aracıdır. Uzun okuma teknolojileri, binlerce harf uzunluğundaki tek molekülleri okur. Tekrarlayan bölgelerin ve büyük yapısal değişikliklerin üstesinden gelmede daha iyidirler ve iki yaklaşım giderek birlikte kullanılmaktadır.
Sizin için neden önemli
NGS genomu paralel olarak okuduğu için, yalnızca önceden seçilmiş birkaç konum yerine tüm genomu dizilemek pratiktir. Tüm genom dizilemesi ile yalnızca seçilmiş genlere veya bilinen belirteçlere bakan testler arasındaki fark budur.