Preparación de la muestra: ¿qué ocurre antes de secuenciar su ADN?
Antes de poder secuenciar su ADN, necesitamos preparar moléculas individuales que puedan cargarse en nuestro secuenciador.
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Tu genoma tiene unos tres mil millones de letras, escritas con cuatro bases químicas: A, C, G y T. Leerlo significa averiguar el orden de esas letras. La secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés) es la familia de tecnologías que hizo posible leer un genoma humano completo de forma rápida y rutinaria, al leer millones de fragmentos cortos de ADN al mismo tiempo en lugar de uno por uno.
Antes de la NGS: un fragmento a la vez
El primer método práctico, la secuenciación Sanger, se desarrolló en los años setenta. Lee un único tramo de ADN, de hasta unas mil letras, por reacción. Es muy preciso y todavía se usa para confirmar resultados individuales, pero leer un genoma completo de esta forma implicaría repetirlo millones de veces. El Proyecto Genoma Humano, que lo utilizó para producir el primer genoma de referencia, tardó trece años y contó con laboratorios de todo el mundo.
La gran idea: secuenciación masivamente paralela
La NGS divide el genoma en millones de fragmentos cortos y los lee todos a la vez. Cada fragmento produce una secuencia corta, llamada lectura, y una sola ejecución del instrumento puede generar miles de millones de ellas. Después, el software vuelve a unir las lecturas. Ese paralelismo es lo que convirtió un proyecto de una década en algo que un laboratorio puede hacer en días.
Cómo funciona, paso a paso
- Extracción. Se purifica el ADN de una muestra, como la saliva, que contiene células del interior de la mejilla.
- Preparación de la biblioteca. El ADN se corta en fragmentos cortos, normalmente de unos cientos de letras, y en cada extremo se unen secuencias sintéticas cortas llamadas adaptadores. Los adaptadores permiten que el instrumento capture y lea cada fragmento.
- Amplificación. En las plataformas más utilizadas, los fragmentos se unen a una celda de flujo de vidrio y se copian en el mismo lugar, de modo que cada uno crece hasta formar un grupo compacto de copias idénticas, lo bastante brillante como para detectarse.
- Secuenciación por síntesis. El instrumento construye una nueva cadena junto a cada fragmento, una letra por ciclo, usando bases marcadas con un color fluorescente distinto para A, C, G y T. Una cámara registra qué color se ilumina en cada grupo, ciclo tras ciclo, y la secuencia de colores se convierte en la secuencia de letras.
- Lecturas. El resultado es un archivo muy grande de lecturas cortas, a menudo de unas 150 letras cada una, frecuentemente leídas desde ambos extremos de un fragmento (lecturas pareadas), con una puntuación de calidad para cada letra.
Cobertura: por qué cada letra se lee muchas veces
Ninguna lectura individual es perfecta, por lo que cada posición del genoma se lee muchas veces mediante fragmentos superpuestos. El número medio de lecturas que cubren una posición se denomina cobertura o profundidad. La secuenciación clínica del genoma completo suele apuntar a una media de unas 30x, lo que significa que cada letra se lee alrededor de treinta veces, lo cual permite distinguir las diferencias reales de los errores de lectura ocasionales.
De las lecturas a los resultados
Las lecturas en bruto son solo el comienzo. El software de bioinformática alinea cada lectura con su lugar en un genoma humano de referencia y, después, compara tu secuencia con la referencia para encontrar las posiciones donde difieren, un paso llamado detección de variantes. Esas variantes se anotan luego con lo que se conoce sobre ellas.
Lecturas cortas y lecturas largas
El método descrito anteriormente produce lecturas cortas, que son muy precisas y económicas, y es el caballo de batalla de la secuenciación del genoma completo. Las tecnologías de lectura larga leen moléculas individuales de miles de letras. Son mejores para abarcar regiones repetitivas y cambios estructurales de gran tamaño, y ambos enfoques se usan cada vez más juntos.
Por qué te importa
Como NGS lee el genoma en paralelo, resulta práctico secuenciarlo completo en lugar de unas pocas posiciones preseleccionadas. Esa es la diferencia entre la secuenciación del genoma completo y las pruebas que solo analizan genes seleccionados o marcadores conocidos.