Hva er neste generasjons sekvensering?

Genomet ditt er omtrent tre milliarder bokstaver langt, skrevet med fire kjemiske baser: A, C, G og T. Å lese det innebærer å finne ut rekkefølgen på disse bokstavene. Neste generasjons sekvensering (NGS) er samlebetegnelsen for teknologiene som gjorde det raskt og rutinemessig å lese et helt menneskegenom, ved å lese millioner av korte DNA-biter samtidig i stedet for én om gangen.

Før NGS: ett fragment om gangen

Den første praktiske metoden, Sanger-sekvensering, ble utviklet på 1970-tallet. Den leser ett DNA-strekk, opptil omtrent tusen bokstaver, per reaksjon. Metoden er svært nøyaktig og brukes fortsatt for å bekrefte enkeltresultater, men å lese et helt genom på denne måten betyr å gjenta prosessen millioner av ganger. Human Genome Project, som brukte metoden til å lage det første referansegenomet, tok tretten år og involverte laboratorier over hele verden.

Hovedidéen: massivt parallell sekvensering

NGS deler genomet opp i millioner av korte fragmenter og leser alle samtidig. Hvert fragment gir en kort sekvens, kalt en lesning, og en enkelt kjøring i instrumentet kan produsere milliarder av dem. Programvaren setter deretter lesningene sammen igjen. Det er denne parallelliteten som gjorde et prosjekt på over ti år til noe et laboratorium kan gjøre på noen få dager.

Slik fungerer det, steg for steg

1. Ekstraksjon. DNA renses fra en prøve, for eksempel spytt, som inneholder celler fra innsiden av kinnet ditt.
2. Biblioteksforberedelse. DNA kuttes i korte fragmenter, vanligvis noen hundre bokstaver lange, og korte syntetiske sekvenser kalt adaptere festes til hver ende. Adapterne gjør at hvert fragment kan fanges opp og leses av instrumentet.
3. Amplifisering. På de mest brukte plattformene festes fragmentene til en glassflowcelle og kopieres på stedet, slik at hvert fragment vokser til en tett klynge av identiske kopier som er sterk nok til å oppdages.
4. Sekvensering ved syntese. Instrumentet bygger en ny tråd ved siden av hvert fragment, én bokstav per syklus, ved hjelp av baser merket med ulik fluorescerende farge for A, C, G og T. Et kamera registrerer hvilken farge som lyser i hver klynge, syklus for syklus, og fargesekvensen blir til bokstavsekvensen.
5. Lesninger. Resultatet er en svært stor fil med korte lesninger, ofte rundt 150 bokstaver hver. De leses ofte fra begge ender av et fragment (parvise lesninger), og hver bokstav får en kvalitetsscore.

Dekning: hvorfor hver bokstav leses mange ganger

Ingen enkelt lesning er perfekt, så hver posisjon i genomet leses mange ganger av overlappende fragmenter. Det gjennomsnittlige antallet lesninger som dekker en posisjon, kalles dekning eller dybde. Kliniske helgenomsekvenseringer har vanligvis som mål en gjennomsnittlig dekning på omtrent 30x, altså at hver bokstav leses rundt tretti ganger. Det gjør det mulig å skille reelle forskjeller fra sporadiske lesefeil.

Fra lesninger til resultater

Rålesninger er bare begynnelsen. Bioinformatikkprogramvare plasserer hver lesning på riktig sted i et referansegenom for mennesker, og sammenligner deretter sekvensen din med referansen for å finne posisjonene der de avviker. Dette trinnet kalles variantkalling. Variantene annoteres deretter med det som er kjent om dem.

Korte og lange lesninger

Metoden beskrevet over gir korte lesninger, som er svært nøyaktige og økonomiske, og er arbeidshesten i helgenomsekvensering. Teknologier for lange lesninger leser enkeltmolekyler som er tusenvis av bokstaver lange. De er bedre til å dekke repeterende regioner og store strukturelle endringer, og de to tilnærmingene brukes i økende grad sammen.

Hvorfor det betyr noe for deg

Fordi NGS leser genomet parallelt, er det praktisk å sekvensere alt av det i stedet for en håndfull forhåndsvalgte posisjoner. Det er forskjellen mellom helgenomsekvensering og tester som bare ser på utvalgte gener eller kjente markører.