Kas yra kitos kartos sekvenavimas?

Jūsų genomas yra maždaug trijų milijardų raidžių ilgio ir sudarytas iš keturių cheminių bazių: A, C, G ir T. Jį perskaityti reiškia nustatyti šių raidžių eilę. Kitos kartos sekvenavimas (NGS) – tai technologijų grupė, kuri padarė viso žmogaus genomo nuskaitymą greitu ir įprastu dalyku, nes vienu metu nuskaito milijonus trumpų DNR dalių, o ne po vieną.

Prieš NGS: po vieną fragmentą

Pirmasis praktiškai taikytas metodas, Sangerio sekvenavimas, buvo sukurtas 1970-aisiais. Vienoje reakcijoje jis nuskaito vieną DNR ruožą, iki maždaug tūkstančio raidžių. Jis labai tikslus ir vis dar naudojamas atskiriems rezultatams patvirtinti, tačiau visam genomui nuskaityti tokiu būdu reikėtų kartoti procedūrą milijonus kartų. Žmogaus genomo projektas, kuriame šiuo metodu buvo sukurtas pirmasis etaloninis genomas, truko trylika metų ir reikalavo laboratorijų visame pasaulyje.

Pagrindinė idėja: masiškai lygiagretus sekvenavimas

NGS genomą suskaido į milijonus trumpų fragmentų ir nuskaito visus vienu metu. Kiekvienas fragmentas duoda trumpą seką, vadinamą nuskaitymu, o vienas prietaiso ciklas gali sugeneruoti milijardus tokių nuskaitymų. Tada programinė įranga surenka nuskaitymus į visumą. Būtent šis lygiagretumas paverčia dešimtmetį trukusį projektą darbu, kurį laboratorija gali atlikti per kelias dienas.

Kaip tai veikia, žingsnis po žingsnio

1. Išskyrimas. DNR išgaunama iš mėginio, pavyzdžiui, seilių, kuriose yra skruosto vidaus ląstelių.
2. Bibliotekos paruošimas. DNR supjaustoma į trumpus fragmentus, paprastai kelių šimtų raidžių ilgio, o prie kiekvieno galo prijungiamos trumpos sintetinės sekos, vadinamos adapteriais. Adapteriai leidžia prietaisui užfiksuoti ir nuskaityti kiekvieną fragmentą.
3. Amplifikacija. Plačiausiai naudojamose platformose fragmentai prisitvirtina prie stiklinės tekėjimo ląstelės ir yra kopijuojami vietoje, todėl kiekvienas išauga į tankų identiškų kopijų klasterį, pakankamai ryškų, kad jį būtų galima aptikti.
4. Sekvenavimas sintezės būdu. Prietaisas prie kiekvieno fragmento per vieną ciklą po vieną raidę sukuria naują grandinę, naudodamas bazes, pažymėtas skirtingos spalvos fluorescencine žymele A, C, G ir T. Kamera fiksuoja, kuri spalva užsidega kiekviename klasteryje ciklas po ciklo, ir spalvų seka tampa raidžių seka.
5. Nuskaitymai. Rezultatas – labai didelis failas su trumpais nuskaitymais, dažnai maždaug 150 raidžių kiekvienas, dažnai nuskaitytais iš abiejų fragmento galų (poriniai nuskaitymai), o kiekvienai raidei priskiriamas kokybės įvertis.

Padengimas: kodėl kiekviena raidė nuskaitoma daug kartų

Joks atskiras nuskaitymas nėra tobulas, todėl kiekviena genomo pozicija nuskaitoma daug kartų persidengiančių fragmentų. Vidutinis skaičius nuskaitymų, padengiančių poziciją, vadinamas padengimu arba gyliu. Klinikiniuose visų genomų sekvenavimo tyrimuose paprastai siekiama vidutiniškai maždaug 30x padengimo, t. y. kiekviena raidė nuskaitoma maždaug trisdešimt kartų, o tai leidžia atskirti tikrus skirtumus nuo atsitiktinių nuskaitymo klaidų.

Nuo nuskaitymų iki rezultatų

Žali nuskaitymai – tik pradžia. Bioinformatikos programinė įranga kiekvieną nuskaitymą suderina su jo vieta etaloniniame žmogaus genome, tada palygina jūsų seką su etaloniniu genomu, kad rastų pozicijas, kuriose jos skiriasi – šis žingsnis vadinamas variantų nustatymu. Tada šiems variantams priskiriama tai, kas apie juos žinoma.

Trumpi ir ilgi nuskaitymai

Aprašytas metodas sukuria trumpus nuskaitymus, kurie yra labai tikslūs ir ekonomiški, ir yra pagrindinis visų genomų sekvenavimo darbininkas. Ilgųjų nuskaitymų technologijos nuskaito atskiras molekules, kurių ilgis siekia tūkstančius raidžių. Jos geriau tinka pasikartojantiems ruožams ir dideliems struktūriniams pokyčiams aprėpti, o abu metodai vis dažniau naudojami kartu.

Kodėl tai svarbu jums

Kadangi NGS skaito genomą lygiagrečiai, praktiška sekvenuoti visą genomą, o ne kelias iš anksto pasirinktas pozicijas. Būtent tuo viso genomo sekoskaita skiriasi nuo testų, kurie tiria tik pasirinktus genus ar žinomus žymenis.