Příprava vzorku: co se děje, než sekvenujeme vaši DNA?
Než můžeme sekvenovat vaši DNA, musíme připravit jednotlivé molekuly, které lze vložit do našeho sekvenátoru.
4 min čtení
Váš genom má přibližně tři miliardy písmen zapsaných čtyřmi chemickými bázemi: A, C, G a T. Přečíst jej znamená zjistit pořadí těchto písmen. Sekvenování nové generace (NGS) je souhrn technologií, které díky tomu, že čtou miliony krátkých úseků DNA současně místo jednoho po druhém, zpřístupnily rychlé a rutinní čtení celého lidského genomu.
Před NGS: jeden úsek po druhém
První praktická metoda, Sangerovo sekvenování, vznikla v 70. letech 20. století. Přečte jeden úsek DNA dlouhý zhruba tisíc písmen v jedné reakci. Je velmi přesná a dodnes se používá k potvrzení jednotlivých výsledků, ale přečíst tímto způsobem celý genom znamená opakovat ji milionkrát. Projekt lidského genomu, který jej použil k vytvoření prvního referenčního genomu, trval třináct let a zapojily se do něj laboratoře z celého světa.
Hlavní myšlenka: masivně paralelní sekvenování
NGS rozdělí genom na miliony krátkých úseků a přečte je všechny najednou. Každý úsek dá krátkou sekvenci, nazývanou čtení, a jediný běh přístroje jich může vytvořit miliardy. Software pak čtení znovu poskládá. Právě tato paralelnost proměnila projekt trvající desetiletí v něco, co laboratoř zvládne během několika dnů.
Jak to funguje krok za krokem
- Extrakce. DNA se izoluje ze vzorku, například ze slin, které obsahují buňky z vnitřní strany tváře.
- Příprava knihovny. DNA se rozštěpí na krátké úseky, obvykle dlouhé několik set písmen, a na každý konec se připojí krátké uměle vytvořené sekvence zvané adaptéry. Adaptéry umožňují, aby přístroj každý úsek zachytil a přečetl.
- Amplifikace. U nejrozšířenějších platforem se úseky připojí ke skleněné průtokové kyvetě a na místě se zkopírují, takže každý vyroste do husté shluky identických kopií, která je dostatečně jasná, aby se dala detekovat.
- Sekvenování syntézou. Přístroj vytváří nové vlákno vedle každého úseku, jedno písmeno v cyklu, s použitím bází značených různými fluorescenčními barvami pro A, C, G a T. Kamera zaznamenává, která barva se v každém shluku rozsvítí, cyklus za cyklem, a posloupnost barev se stane posloupností písmen.
- Čtení. Výsledkem je velmi velký soubor krátkých čtení, často dlouhých zhruba 150 písmen, často čtených z obou konců úseku (párová čtení), s kvalitním skóre pro každé písmeno.
Pokrytí: proč je každé písmeno čteno mnohokrát
Žádné jednotlivé čtení není dokonalé, proto je každá pozice v genomu čtena mnohokrát překrývajícími se úseky. Průměrný počet čtení pokrývajících pozici se nazývá pokrytí nebo hloubka. Klinické sekvenování celého genomu běžně cílí na průměr přibližně 30x, což znamená, že každé písmeno je čteno zhruba třicetkrát, a to umožňuje odlišit skutečné rozdíly od občasných chyb čtení.
Od čtení k výsledkům
Surová čtení jsou jen začátek. Bioinformatický software zarovná každé čtení na jeho místo v referenčním lidském genomu a poté porovná vaši sekvenci s referencí, aby našel pozice, kde se liší; tento krok se nazývá volání variant. Tyto varianty se pak anotují tím, co je o nich známo.
Krátká a dlouhá čtení
Výše popsaná metoda produkuje krátká čtení, která jsou vysoce přesná a ekonomická, a je hlavním koněm sekvenování celých genomů. Technologie dlouhých čtení čtou jednotlivé molekuly dlouhé tisíce písmen. Lépe překlenují opakující se oblasti a velké strukturní změny a tyto přístupy se stále častěji používají společně.
Proč na tom záleží pro vás
Protože NGS čte genom paralelně, je praktické sekvenovat celý genom namísto několika předem vybraných míst. V tom spočívá rozdíl mezi celogenomovým sekvenováním a testy, které se dívají jen na vybrané geny nebo známé markery.