Préparation de l'échantillon : que se passe-t-il avant le séquençage de votre ADN ?
Avant de pouvoir séquencer votre ADN, nous devons préparer des molécules individuelles qui pourront être chargées dans notre séquenceur.
Lecture de 4 min
Votre génome compte environ trois milliards de lettres, écrites avec quatre bases chimiques : A, C, G et T. Le lire revient à déterminer l'ordre de ces lettres. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) regroupe les technologies qui ont rendu la lecture d'un génome humain complet rapide et courante, en lisant simultanément des millions de courts fragments d'ADN au lieu d'un seul à la fois.
Avant le NGS : un fragment à la fois
La première méthode utilisable, le séquençage Sanger, a été mise au point dans les années 1970. Elle lit une seule portion d'ADN, pouvant aller jusqu'à environ mille lettres, par réaction. Elle est très précise et sert encore à confirmer des résultats individuels, mais lire un génome entier de cette façon exigerait de la répéter des millions de fois. Le Projet génome humain, qui l'a utilisée pour produire le premier génome de référence, a duré treize ans et mobilisé des laboratoires du monde entier.
L'idée clé : le séquençage massivement parallèle
Le NGS découpe le génome en millions de courts fragments et les lit tous en même temps. Chaque fragment donne une courte séquence, appelée lecture, et un seul passage sur l'instrument peut en produire des milliards. Le logiciel reconstitue ensuite le génome à partir de ces lectures. C'est ce parallélisme qui a transformé un projet de dix ans en une opération qu'un laboratoire peut réaliser en quelques jours.
Son fonctionnement, étape par étape
- Extraction. L'ADN est purifié à partir d'un échantillon, par exemple de salive, qui contient des cellules prélevées à l'intérieur de la joue.
- Préparation de la bibliothèque. L'ADN est découpé en courts fragments, généralement de quelques centaines de lettres, et de courtes séquences synthétiques appelées adaptateurs sont fixées à chaque extrémité. Les adaptateurs permettent à chaque fragment d'être capturé et lu par l'instrument.
- Amplification. Sur les plateformes les plus utilisées, les fragments se fixent sur une cellule de flux en verre et y sont recopiés sur place : chacun devient un amas serré de copies identiques, suffisamment lumineux pour être détecté.
- Séquençage par synthèse. L'instrument construit un nouveau brin le long de chaque fragment, une lettre à chaque cycle, en utilisant des bases marquées d'une couleur fluorescente différente pour A, C, G et T. Une caméra enregistre à chaque cycle la couleur qui s'allume dans chaque amas, et la suite de couleurs devient la suite de lettres.
- Lectures. Le résultat est un très grand fichier de courtes lectures, souvent d'environ 150 lettres chacune, fréquemment lues à partir des deux extrémités d'un fragment (lectures appariées), avec un score de qualité pour chaque lettre.
Couverture : pourquoi chaque lettre est lue de nombreuses fois
Aucune lecture isolée n'est parfaite ; chaque position du génome est donc lue plusieurs fois par des fragments qui se chevauchent. Le nombre moyen de lectures couvrant une position s'appelle la couverture ou profondeur. Le séquençage du génome entier à visée clinique vise généralement une moyenne d'environ 30x, ce qui signifie que chaque lettre est lue une trentaine de fois. Cela permet de distinguer de véritables différences des erreurs de lecture occasionnelles.
Des lectures aux résultats
Les lectures brutes ne sont que le point de départ. Un logiciel de bioinformatique place chaque lecture à sa position dans un génome humain de référence, puis compare votre séquence à la référence pour repérer les positions où elles diffèrent, une étape appelée identification des variants. Ces variants sont ensuite annotés avec ce que l'on sait à leur sujet.
Lectures courtes et lectures longues
La méthode décrite ci-dessus produit des lectures courtes, très précises et économiques, et reste le cheval de bataille du séquençage du génome entier. Les technologies de lectures longues lisent des molécules uniques de plusieurs milliers de lettres. Elles sont plus performantes pour traverser les régions répétitives et les grands remaniements structuraux, et les deux approches sont de plus en plus utilisées ensemble.
Pourquoi cela compte pour vous
Comme le NGS lit le génome en parallèle, il est pratique de séquencer la totalité de celui-ci plutôt que quelques positions choisies à l'avance. C'est la différence entre le séquençage du génome entier et les tests qui n'examinent que certains gènes sélectionnés ou des marqueurs connus.