Monstervoorbereiding: wat gebeurt er voordat we uw DNA sequencen?
Voordat we uw DNA kunnen sequencen, moeten we afzonderlijke moleculen voorbereiden die in onze sequencer geladen kunnen worden.
4 min leestijd
Uw genoom bestaat uit ongeveer drie miljard letters, opgebouwd uit vier chemische bases: A, C, G en T. Het lezen ervan betekent dat de volgorde van die letters wordt vastgesteld. Next-generation sequencing (NGS) is de verzameling technieken die het lezen van een volledig menselijk genoom snel en routinematig heeft gemaakt, doordat miljoenen korte stukjes DNA tegelijk worden gelezen in plaats van één voor één.
Vóór NGS: één fragment tegelijk
De eerste praktische methode, Sanger-sequencing, werd in de jaren zeventig ontwikkeld. Per reactie leest ze één DNA-stuk van maximaal ongeveer duizend letters. Ze is zeer nauwkeurig en wordt nog steeds gebruikt om afzonderlijke resultaten te bevestigen, maar om zo een volledig genoom te lezen moet de methode miljoenen keren worden herhaald. Het Human Genome Project, dat deze methode gebruikte om het eerste referentiegenoom te produceren, duurde dertien jaar en vergde laboratoria over de hele wereld.
Het grote idee: massaal parallel sequencen
NGS breekt het genoom op in miljoenen korte fragmenten en leest ze allemaal tegelijk. Elk fragment levert een korte reeks op, een read genoemd, en één run van een apparaat kan er miljarden opleveren. Software zet de reads vervolgens weer in elkaar. Dankzij die parallelliteit is een project dat ooit tien jaar duurde iets geworden dat een laboratorium in dagen kan uitvoeren.
Hoe het werkt, stap voor stap
- Extractie. Het DNA wordt uit een monster gezuiverd, zoals speeksel, dat cellen van de binnenkant van uw wang bevat.
- Bibliotheekvoorbereiding. Het DNA wordt in korte fragmenten geknipt, meestal van enkele honderden letters lang, en aan elk uiteinde worden korte synthetische sequenties bevestigd die adapters heten. Dankzij de adapters kan elk fragment door het apparaat worden gevangen en gelezen.
- Amplificatie. Op de meest gebruikte platforms hechten fragmenten zich aan een glazen flowcel en worden ze ter plekke gekopieerd, zodat elk fragment uitgroeit tot een compact cluster van identieke kopieën dat helder genoeg is om te detecteren.
- Sequencing door synthese. Het apparaat bouwt per cyclus één letter per keer een nieuwe streng naast elk fragment, met bases die voor A, C, G en T elk met een andere fluorescerende kleur zijn gelabeld. Een camera registreert in elk cluster welke kleur oplicht, cyclus na cyclus, en de volgorde van kleuren wordt de volgorde van letters.
- Reads. Het resultaat is een zeer groot bestand met korte reads, vaak van ongeveer 150 letters elk, die regelmatig van beide uiteinden van een fragment worden gelezen (paired-end reads), met een kwaliteitsscore voor elke letter.
Dekking: waarom elke letter vele keren wordt gelezen
Geen enkele read is perfect, daarom wordt elke positie in het genoom door overlappende fragmenten vele keren gelezen. Het gemiddelde aantal reads dat een positie bedekt, heet dekking of diepte. Klinische volledige genoomsequencing streeft doorgaans naar een gemiddelde van ongeveer 30x, wat betekent dat elke letter ongeveer dertig keer wordt gelezen. Zo kunnen echte verschillen worden onderscheiden van incidentele leesfouten.
Van reads naar resultaten
Ruwe reads vormen slechts het begin. Bioinformatica-software lijnt elke read uit op de plaats die hij inneemt in een referentie-genoom van de mens, en vergelijkt daarna uw sequentie met de referentie om de posities te vinden waar ze verschillen. Deze stap heet variant calling. De gevonden varianten worden vervolgens geannoteerd met wat er over hen bekend is.
Korte reads en lange reads
De hierboven beschreven methode levert korte reads op, die zeer nauwkeurig en economisch zijn, en is het werkpaard van volledige genoomsequencing. Technieken met lange reads lezen afzonderlijke moleculen van duizenden letters lang. Ze zijn beter in het overbruggen van repetitieve regio's en grote structurele veranderingen, en de twee benaderingen worden steeds vaker samen gebruikt.
Waarom het voor u van belang is
Omdat NGS het genoom parallel uitleest, is het praktisch om het hele genoom te sequencen in plaats van een handvol vooraf gekozen posities. Dat is het verschil tussen whole genome sequencing en tests die alleen naar geselecteerde genen of bekende markers kijken.