Näytteen valmistelu: mitä tapahtuu ennen kuin sekvensoimme DNA:si?
Ennen kuin voimme sekvensoida DNA:si, meidän on valmisteltava yksittäisiä molekyylejä, jotka voidaan ladata sekvensoriimme.
4 min lukuaika
Genomisi on noin kolme miljardia kirjainta pitkä ja kirjoitettu neljällä kemiallisella emäksellä: A, C, G ja T. Sen lukeminen tarkoittaa näiden kirjainten järjestyksen selvittämistä. Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on teknologioiden kokonaisuus, joka teki ihmisen koko genomin lukemisesta nopeaa ja rutiininomaista: se lukee miljoonia lyhyitä DNA-palasia samanaikaisesti sen sijaan, että lukisi niitä yksi kerrallaan.
Ennen NGS:ää: yksi fragmentti kerrallaan
Ensimmäinen käytännöllinen menetelmä, Sanger-sekvensointi, kehitettiin 1970-luvulla. Se lukee yhdessä reaktiossa yhden DNA-jakson, enintään noin tuhat kirjainta. Menetelmä on hyvin tarkka, ja sitä käytetään edelleen yksittäisten tulosten vahvistamiseen, mutta koko genomin lukeminen sillä tarkoittaisi toistoa miljoonia kertoja. Ihmisen genomiprojekti, joka käytti menetelmää ensimmäisen viitegenomin tuottamiseen, kesti kolmetoista vuotta ja vaati laboratorioita ympäri maailmaa.
Suuri idea: massiivisesti rinnakkainen sekvensointi
NGS pilkkoo genomin miljooniksi lyhyiksi fragmenteiksi ja lukee ne kaikki kerralla. Jokainen fragmentti tuottaa lyhyen sekvenssin, jota kutsutaan lukemaksi, ja yksi laitteen ajo voi tuottaa niitä miljardeja. Ohjelmisto kokoaa lukemat sitten takaisin yhteen. Tämä rinnakkaisuus muutti vuosikymmenen mittaisen hankkeen sellaiseksi, minkä laboratorio voi tehdä päivissä.
Vaihe vaiheelta
- Eristäminen. DNA puhdistetaan näytteestä, esimerkiksi sylkinäytteestä, jossa on poskesi sisäpinnan soluja.
- Kirjastovalmistelu. DNA pilkotaan lyhyiksi fragmenteiksi, tyypillisesti muutaman sadan kirjaimen pituisiksi, ja jokaiseen päähän kiinnitetään lyhyet synteettiset sekvenssit, joita kutsutaan sovittimiksi. Sovittimien ansiosta laite voi tallentaa ja lukea jokaisen fragmentin.
- Monistaminen. Yleisimmillä alustoilla fragmentit kiinnittyvät lasiseen virtauskennoon ja kopioituvat paikallaan, jolloin jokaisesta kasvaa tiivis klusteri identtisiä kopioita, joka on riittävän kirkas havaittavaksi.
- Synteesin kautta sekvensointi. Laite rakentaa jokaisen fragmentin viereen uuden juosteen yksi kirjain syklissä käyttäen emäksiä, joihin on kiinnitetty eri väristä fluoresoivaa merkkiä A:lle, C:lle, G:lle ja T:lle. Kamera tallentaa, mikä väri syttyy kussakin klusterissa syklistä toiseen, ja värien järjestyksestä tulee kirjainten järjestys.
- Lukemat. Tuloksena on hyvin suuri tiedosto lyhyitä lukemia, usein noin 150 kirjaimen pituisia, jotka luetaan usein fragmentin molemmista päistä (paripäinen luku), ja jokaiselle kirjaimelle on laatupistemäärä.
Peitto: miksi jokainen kirjain luetaan monta kertaa
Yksikään yksittäinen lukema ei ole täydellinen, joten jokainen genomin kohta luetaan monta kertaa päällekkäisten fragmenttien avulla. Kohtaa peittävien lukemien keskimääräistä määrää kutsutaan peitoksi tai syvyydeksi. Kliininen koko genomin sekvensointi tähtää yleensä keskimäärin noin 30-kertaiseen peittoon, mikä tarkoittaa, että jokainen kirjain luetaan noin kolmekymmentä kertaa. Näin todelliset erot voidaan erottaa satunnaisista lukuvirheistä.
Lukemista tuloksiin
Raakalukemat ovat vasta alkua. Bioinformatiikkaohjelmisto kohdistaa jokaisen lukeman paikkaansa ihmisen viitegenomissa ja vertaa sitten omaa sekvenssiäsi viitteeseen löytääkseen kohdat, joissa ne eroavat. Tätä vaihetta kutsutaan variantin tunnistukseksi. Löydetyt variantit merkitään sitten sen perusteella, mitä niistä tiedetään.
Lyhyet ja pitkät lukemat
Edellä kuvattu menetelmä tuottaa lyhyitä lukemia, jotka ovat erittäin tarkkoja ja taloudellisia, ja se on koko genomin sekvensoinnin työhevonen. Pitkän lukemisen teknologiat lukevat yksittäisiä molekyylejä, jotka ovat tuhansia kirjaimia pitkiä. Ne soveltuvat paremmin toistuvien alueiden ja suurten rakenteellisten muutosten kattamiseen, ja näitä kahta lähestymistapaa käytetään yhä useammin yhdessä.
Miksi tämä on sinulle tärkeää
Koska NGS lukee genomia rinnakkain, koko genomin sekvensointi on käytännöllistä eikä vain muutamaa etukäteen valittua kohtaa. Ero on siinä, että koko genomin sekvensointi eroaa testeistä, jotka tarkastelevat vain valittuja geenejä tai tunnettuja merkkejä.