Pregătirea probei: ce se întâmplă înainte de secvențierea ADN-ului dumneavoastră?
Înainte de a putea secvenția ADN-ul dumneavoastră, trebuie să pregătim molecule individuale care pot fi încărcate în secvențiatorul nostru.
4 min de citire
Genomul dumneavoastră are aproximativ trei miliarde de litere, scrise cu patru baze chimice: A, C, G și T. A-l citi înseamnă a stabili ordinea acestor litere. Secvențierea de nouă generație (NGS) este familia de tehnologii care a făcut citirea unui genom uman întreg rapidă și de rutină, citind simultan milioane de bucăți scurte de ADN, în loc să le citească una câte una.
Înainte de NGS: câte un fragment pe rând
Prima metodă practică, secvențierea Sanger, a fost dezvoltată în anii 1970. Citește o porțiune unică de ADN, de până la aproximativ o mie de litere, per reacție. Este foarte precisă și este folosită în continuare pentru a confirma rezultate individuale, însă citirea unui genom întreg în acest mod înseamnă repetarea procesului de milioane de ori. Proiectul Genomul Uman, care a folosit această metodă pentru a produce primul genom de referință, a durat treisprezece ani și a implicat laboratoare din întreaga lume.
Ideea esențială: secvențierea masiv paralelă
NGS împarte genomul în milioane de fragmente scurte și le citește pe toate deodată. Fiecare fragment produce o secvență scurtă, numită read, iar o singură rulare a instrumentului poate genera miliarde dintre acestea. Apoi, software-ul reasamblează secvențele citite. Acest paralelism este ceea ce a transformat un proiect de un deceniu într-ceva ce un laborator poate face în câteva zile.
Cum funcționează, pas cu pas
- Extracție. ADN-ul este purificat dintr-o probă, cum ar fi saliva, care conține celule din interiorul obrazului.
- Pregătirea bibliotecii. ADN-ul este tăiat în fragmente scurte, de obicei de câteva sute de litere, iar la fiecare capăt se atașează secvențe sintetice scurte, numite adaptori. Adaptorii permit ca fiecare fragment să fie captat și citit de instrument.
- Amplificare. Pe platformele cel mai larg utilizate, fragmentele se atașează de o celulă de curgere din sticlă și sunt copiate pe loc, astfel că fiecare fragment crește într-un grup compact de copii identice, suficient de luminos pentru a fi detectat.
- Secvențierea prin sinteză. Instrumentul construiește un nou lanț alături de fiecare fragment, câte o literă pe ciclu, folosind baze marcate cu o culoare fluorescentă diferită pentru A, C, G și T. O cameră înregistrează ce culoare se aprinde în fiecare grup, ciclu după ciclu, iar șirul de culori devine șirul de litere.
- Read-uri. Rezultatul este un fișier foarte mare de secvențe scurte, de obicei de aproximativ 150 de litere fiecare, citite adesea de la ambele capete ale unui fragment (read-uri pereche), fiecare literă având un scor de calitate.
Acoperirea: de ce fiecare literă este citită de multe ori
Nicio secvență citită nu este perfectă, de aceea fiecare poziție din genom este citită de multe ori de fragmente care se suprapun. Numărul mediu de secvențe care acoperă o poziție se numește acoperire sau adâncime. Secvențierea clinică a genomului întreg vizează, de obicei, o medie de aproximativ 30x, adică fiecare literă este citită de aproximativ treizeci de ori, ceea ce permite deosebirea diferențelor reale de erorile ocazionale de citire.
De la secvențe citite la rezultate
Secvențele brute sunt doar începutul. Software-ul bioinformatic aliniază fiecare secvență citită la poziția sa într-un genom uman de referință, apoi compară secvența dumneavoastră cu referința pentru a identifica pozițiile în care acestea diferă, un pas numit apelarea variantelor. Aceste variante sunt apoi adnotate cu ceea ce se cunoaște despre ele.
Read-uri scurte și read-uri lungi
Metoda descrisă mai sus produce read-uri scurte, care sunt foarte precise și economice și reprezintă principalul instrument al secvențierii genomului întreg. Tehnologiile cu read-uri lungi citesc molecule unice de mii de litere. Ele sunt mai bune în a acoperi regiuni repetitive și modificări structurale mari, iar cele două abordări sunt din ce în ce mai des folosite împreună.
De ce contează pentru dumneavoastră
Deoarece NGS citește genomul în paralel, este practic să se secvențieze tot genomul, nu doar câteva poziții alese dinainte. Aceasta este diferența dintre secvențierea întregului genom și testele care analizează doar gene selectate sau markeri cunoscuți.