Przygotowanie próbki: co dzieje się przed sekwencjonowaniem Państwa DNA?
Zanim przystąpimy do sekwencjonowania Państwa DNA, musimy przygotować pojedyncze cząsteczki, które można załadować do naszego sekwentera.
Czas czytania: 4 min
Pana/Pani genom liczy około trzech miliardów liter, zapisanych przy użyciu czterech zasad chemicznych: A, C, G i T. Odczytanie go oznacza ustalenie kolejności tych liter. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to grupa technologii, które sprawiły, że odczytanie całego ludzkiego genomu stało się szybkie i rutynowe, ponieważ odczytuje miliony krótkich fragmentów DNA jednocześnie, a nie jeden po drugim.
Przed NGS: jeden fragment naraz
Pierwsza praktyczna metoda, sekwencjonowanie Sangera, powstała w latach 70. XX wieku. Odczytuje ona pojedynczy odcinek DNA, liczący do około tysiąca liter, w ramach jednej reakcji. Jest bardzo dokładna i nadal wykorzystywana do potwierdzania pojedynczych wyników, lecz odczytanie w ten sposób całego genomu wymagałoby powtórzenia procesu miliony razy. Projekt poznania ludzkiego genomu, który dzięki tej metodzie stworzył pierwszy genom referencyjny, trwał trzynaście lat i angażował laboratoria na całym świecie.
Główna idea: masowo równoległe sekwencjonowanie
NGS dzieli genom na miliony krótkich fragmentów i odczytuje je wszystkie naraz. Każdy fragment daje krótką sekwencję, zwaną odczytem, a pojedynczy cykl pracy urządzenia może wytworzyć miliardy takich odczytów. Oprogramowanie następnie składa odczyty z powrotem w całość. To właśnie równoległość sprawiła, że projekt trwający dekadę stał się czymś, co laboratorium może wykonać w ciągu kilku dni.
Jak to działa, krok po kroku
- Ekstrakcja. DNA zostaje wyizolowane z próbki, na przykład śliny, która zawiera komórki z wnętrza policzka.
- Przygotowanie biblioteki. DNA zostaje pocięte na krótkie fragmenty, zazwyczaj kilkusetliterowe, a na każdym ich końcu przyłącza się krótkie syntetyczne sekwencje zwane adapterami. Adaptery umożliwiają urządzeniu wychwycenie i odczytanie każdego fragmentu.
- Amplifikacja. W najczęściej stosowanych platformach fragmenty przyczepiają się do szklanej komórki przepływowej i są kopiowane w miejscu, dzięki czemu każdy z nich tworzy zwartą grupę identycznych kopii, wystarczająco jasną, by ją wykryć.
- Sekwencjonowanie przez syntezę. Urządzenie buduje nową nić obok każdego fragmentu, dodając po jednej literze w każdym cyklu, przy użyciu zasad znakowanych fluorescencyjnie w innym kolorze dla A, C, G i T. Kamera rejestruje, który kolor zaświeci się w każdej grupie, cykl po cyklu, a sekwencja kolorów staje się sekwencją liter.
- Odczyty. Wynikiem jest bardzo duży plik krótkich odczytów, często około 150 liter każdy, zwykle odczytywanych z obu końców fragmentu (odczyty sparowane), wraz z wynikiem jakości dla każdej litery.
Pokrycie: dlaczego każda litera jest odczytywana wielokrotnie
Żaden pojedynczy odczyt nie jest doskonały, dlatego każda pozycja w genomie jest odczytywana wiele razy przez nakładające się fragmenty. Średnia liczba odczytów obejmujących daną pozycję nazywana jest pokryciem lub głębokością. Kliniczne sekwencjonowanie całego genomu zazwyczaj dąży do średniego pokrycia na poziomie około 30x, co oznacza, że każda litera jest odczytywana około trzydzieści razy, a to pozwala odróżnić rzeczywiste różnice od sporadycznych błędów odczytu.
Od odczytów do wyników
Surowe odczyty to dopiero początek. Oprogramowanie bioinformatyczne dopasowuje każdy odczyt do jego miejsca w referencyjnym genomie człowieka, a następnie porównuje Pana/Pani sekwencję z referencją, aby znaleźć pozycje, w których się różnią. Ten etap nazywany jest wykrywaniem wariantów. Wykryte warianty są następnie opisywane na podstawie tego, co o nich wiadomo.
Krótkie i długie odczyty
Opisana metoda wytwarza krótkie odczyty, które są bardzo dokładne i ekonomiczne, i stanowią główne narzędzie sekwencjonowania całych genomów. Technologie długich odczytów odczytują pojedyncze cząsteczki o długości tysięcy liter. Lepiej radzą sobie z regionami powtarzalnymi i dużymi zmianami strukturalnymi, a oba podejścia coraz częściej stosuje się razem.
Dlaczego ma to znaczenie dla Pana/Pani
Ponieważ technologia NGS odczytuje genom równolegle, praktyczne jest sekwencjonowanie całego genomu, a nie tylko kilku wcześniej wybranych pozycji. Na tym polega różnica między sekwencjonowaniem całego genomu a testami, które badają wyłącznie wybrane geny lub znane markery.