Probenvorbereitung: Was passiert, bevor wir Ihre DNA sequenzieren?
Bevor wir Ihre DNA sequenzieren können, müssen wir einzelne Moleküle vorbereiten, die in unser Sequenziergerät geladen werden können.
4 Min. Lesezeit
Ihr Genom umfasst etwa drei Milliarden Buchstaben, die aus vier chemischen Basen bestehen: A, C, G und T. Es zu lesen bedeutet, die Reihenfolge dieser Buchstaben zu ermitteln. Next-Generation-Sequenzierung (NGS) ist die Familie von Technologien, die das Auslesen eines vollständigen menschlichen Genoms schnell und routinemäßig machte, indem sie Millionen kurzer DNA-Stücke gleichzeitig statt nacheinander liest.
Vor NGS: ein Fragment nach dem anderen
Die erste praktikable Methode, die Sanger-Sequenzierung, wurde in den 1970er-Jahren entwickelt. Sie liest pro Reaktion einen einzelnen DNA-Abschnitt von bis zu etwa tausend Buchstaben. Sie ist sehr genau und wird noch heute zur Bestätigung einzelner Ergebnisse verwendet, doch ein ganzes Genom auf diese Weise zu lesen, bedeutet, den Vorgang millionenfach zu wiederholen. Das Humangenomprojekt, das diese Methode für das erste Referenzgenom einsetzte, benötigte dreizehn Jahre und Labore auf der ganzen Welt.
Die große Idee: massiv parallele Sequenzierung
NGS zerlegt das Genom in Millionen kurzer Fragmente und liest sie alle auf einmal. Jedes Fragment ergibt eine kurze Sequenz, eine sogenannte Lesung (Read), und ein einziger Gerätelauf kann Milliarden davon erzeugen. Anschließend setzt Software die Lesungen wieder zusammen. Diese Parallelität hat aus einem jahrzehntelangen Projekt etwas gemacht, das ein Labor in wenigen Tagen erledigen kann.
So funktioniert es, Schritt für Schritt
- Extraktion. Die DNA wird aus einer Probe gewonnen, etwa aus Speichel, der Zellen aus der Wangeninnenseite enthält.
- Bibliotheksvorbereitung. Die DNA wird in kurze Fragmente geschnitten, typischerweise einige hundert Buchstaben lang, und an beiden Enden werden kurze synthetische Sequenzen, sogenannte Adapter, angefügt. Die Adapter ermöglichen es, dass jedes Fragment vom Gerät erfasst und gelesen werden kann.
- Amplifikation. Auf den am weitesten verbreiteten Plattformen haften die Fragmente an einer gläsernen Durchflusszelle und werden an Ort und Stelle kopiert, sodass jedes zu einem dichten Cluster identischer Kopien heranwächst, der hell genug ist, um nachgewiesen zu werden.
- Sequenzierung durch Synthese. Das Gerät baut neben jedem Fragment einen neuen Strang auf, pro Zyklus einen Buchstaben, wobei für A, C, G und T Basen mit jeweils einer anderen fluoreszierenden Farbe verwendet werden. Eine Kamera erfasst in jedem Cluster, welche Farbe aufleuchtet, Zyklus für Zyklus, und die Abfolge der Farben wird zur Abfolge der Buchstaben.
- Lesungen. Das Ergebnis ist eine sehr große Datei mit kurzen Lesungen, oft etwa 150 Buchstaben lang, häufig von beiden Enden eines Fragments gelesen (Paired-End-Lesungen), mit einem Qualitätswert für jeden Buchstaben.
Abdeckung: warum jeder Buchstabe viele Male gelesen wird
Keine einzelne Lesung ist fehlerfrei, deshalb wird jede Position im Genom von überlappenden Fragmenten viele Male gelesen. Die durchschnittliche Anzahl der Lesungen, die eine Position abdecken, nennt man Abdeckung oder Tiefe. Klinische Ganzgenomsequenzierungen zielen üblicherweise auf eine durchschnittliche Abdeckung von etwa 30x, das heißt, jeder Buchstabe wird etwa dreißigmal gelesen. So lassen sich echte Unterschiede von gelegentlichen Lesefehlern unterscheiden.
Von den Lesungen zu den Ergebnissen
Rohe Lesungen sind erst der Anfang. Bioinformatik-Software ordnet jede Lesung ihrer Position in einem menschlichen Referenzgenom zu und vergleicht anschließend Ihre Sequenz mit dem Referenzgenom, um die Positionen zu finden, an denen sie sich unterscheiden. Dieser Schritt heißt Variantenerkennung. Die gefundenen Varianten werden danach mit dem bekannten Wissen über sie annotiert.
Kurze und lange Lesungen
Die oben beschriebene Methode erzeugt kurze Lesungen, die sehr genau und wirtschaftlich sind und das Arbeitspferd der Ganzgenomsequenzierung darstellen. Langlesetechnologien lesen einzelne Moleküle, die tausende Buchstaben lang sind. Sie eignen sich besser für repetitive Regionen und große strukturelle Veränderungen, und beide Ansätze werden zunehmend gemeinsam eingesetzt.
Warum das für Sie wichtig ist
Da NGS das Genom parallel liest, ist es praktikabel, das gesamte Genom zu sequenzieren statt nur einige vorab ausgewählte Stellen. Genau darin liegt der Unterschied zwischen Whole-Genome-Sequenzierung und Tests, die nur ausgewählte Gene oder bekannte Marker untersuchen.