Preparazione del campione: cosa succede prima di sequenziare il suo DNA?
Prima di sequenziare il suo DNA dobbiamo preparare singole molecole che possano essere caricate nel nostro sequenziatore.
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Il suo genoma è lungo circa tre miliardi di lettere, scritte con quattro basi chimiche: A, C, G e T. Leggerlo significa stabilire l'ordine di queste lettere. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è la famiglia di tecnologie che ha reso rapida e di routine la lettura di un intero genoma umano, leggendo milioni di brevi frammenti di DNA contemporaneamente anziché uno alla volta.
Prima dell'NGS: un frammento alla volta
Il primo metodo pratico, il sequenziamento Sanger, fu sviluppato negli anni Settanta. Legge un singolo tratto di DNA, fino a circa mille lettere, per ogni reazione. È molto accurato e viene ancora usato per confermare i singoli risultati, ma leggere un intero genoma con questo metodo significherebbe ripeterlo milioni di volte. Il Progetto Genoma Umano, che lo ha utilizzato per produrre il primo genoma di riferimento, ha richiesto tredici anni e laboratori di tutto il mondo.
L'idea chiave: sequenziamento massivamente parallelo
L'NGS suddivide il genoma in milioni di brevi frammenti e li legge tutti insieme. Ogni frammento produce una breve sequenza, detta lettura, e una singola sessione dello strumento può generarne miliardi. Il software ricompone poi le letture. È questo parallelismo che ha trasformato un progetto durato un decennio in qualcosa che un laboratorio può svolgere in pochi giorni.
Come funziona, passo dopo passo
- Estrazione. Il DNA viene purificato da un campione, come la saliva, che contiene cellule dell'interno della guancia.
- Preparazione della libreria. Il DNA viene tagliato in frammenti corti, tipicamente lunghi poche centinaia di lettere, e a ciascuna estremità vengono agganciate brevi sequenze sintetiche chiamate adattatori. Gli adattatori permettono allo strumento di catturare e leggere ogni frammento.
- Amplificazione. Sulle piattaforme più diffuse, i frammenti si fissano a una cella a flusso di vetro e vengono copiati sul posto, così che ciascuno si moltiplica in un cluster compatto di copie identiche, abbastanza luminoso da essere rilevato.
- Sequenziamento per sintesi. Lo strumento costruisce un nuovo filamento accanto a ciascun frammento, una lettera per ciclo, usando basi marcate con un colore fluorescente diverso per A, C, G e T. Una fotocamera registra quale colore si accende in ogni cluster, ciclo dopo ciclo, e la sequenza dei colori diventa la sequenza delle lettere.
- Letture. Il risultato è un file molto grande di brevi letture, spesso lunghe circa 150 lettere ciascuna, frequentemente lette da entrambe le estremità di un frammento (letture paired-end), con un punteggio di qualità per ogni lettera.
Copertura: perché ogni lettera viene letta più volte
Nessuna singola lettura è perfetta, quindi ogni posizione del genoma viene letta più volte da frammenti sovrapposti. La media di letture che coprono una posizione si chiama copertura o profondità. Il sequenziamento clinico dell'intero genoma mira comunemente a una media di circa 30x, il che significa che ogni lettera viene letta circa trenta volte, e questo permette di distinguere le differenze reali dai rari errori di lettura.
Dalle letture ai risultati
Le letture grezze sono solo l'inizio. Un software di bioinformatica allinea ogni lettura alla sua posizione in un genoma umano di riferimento, poi confronta la sua sequenza con il riferimento per individuare le posizioni in cui differiscono, una fase chiamata variant calling. Queste varianti vengono poi annotate con ciò che si sa su di esse.
Letture corte e letture lunghe
Il metodo descritto sopra produce letture corte, altamente accurate ed economiche, ed è il cavallo di battaglia del sequenziamento dell'intero genoma. Le tecnologie a letture lunghe leggono singole molecole lunghe migliaia di lettere. Sono più efficaci nel coprire regioni ripetitive e grandi alterazioni strutturali, e i due approcci vengono sempre più usati insieme.
Perché è importante per lei
Poiché l'NGS legge il genoma in parallelo, è pratico sequenziarlo per intero anziché limitarsi a un numero ristretto di posizioni scelte in anticipo. È questa la differenza tra il sequenziamento dell'intero genoma e i test che esaminano solo geni selezionati o marcatori noti.